Titlu: Mecanismele moleculare, celulare si integrative ale durerii. Implicatii clinice

 

Scop: Identificarea unor tinte implicate in generarea senzatiei de durere neuropatica care pot fi influentate farmacologic.

 

Rezumat: Durerea cronica este o problema complexa si devastatoare care poate ruina viata unor oameni, fiind vazuta ca o disfunctie cerebrala ce influenteaza atat nociceptia cat si mecanismele centrale de perceptie, procesare si evaluare a senzatiei de durere. Durerea poate fi nociceptiva, inflamatorie sau neuropatica in functie de mecanismele implicate in generarea ei. Ultimele statistici arata ca unul din 5 europeni sufera de aceasta conditie, care reprezinta o disfunctie a sistemului nervos periferic si central. Costurile suportate de societate pentru a sustine persoanele lovite de acest handicap sunt mari, astfel incat gasirea unor metode de tratament mai eficace ar reduce aceasta povara asupra societatii umane. Conditia rationala de a imbunatati tratamentul oricaror boli este intelegerea mecanismelor lor de generare si de evolutie.

Problemele pe care ni le-am propus spre investigare in cadrul acestui proiect sunt:

1. Modificarea activitatii canalelor ionice si a receptorilor implicati in nociceptie in modele experimentale de generare a durerii.
2. Modificari de excitabilitate in circuitele neuronale centrale implicate in durere.
3. Implicatii neurofarmacologice si clinice ale utilizarii unor antidepresive, oligoelemente si oligopeptide in studiul si terapia durerii.

 

Parteneri:

• Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Bucuresti
• Universitatea de Medicina si Farmacie "Carol Davila", Bucuresti
• Universitatea de Medicina si Farmacie " Grigore T.Popa ", Iasi
• Institutul National de cercetare-dezvoltare in domeniul Patologiei si Stiintelor Medicale "Victor Babes"

 

Plan de realizare:

Faza 1

Realizarea modelelelor experimentale si punerea la punct a metodelor de inregistrare.

1. Evaluarea viabilitatii si functionarii culturilor primare de neuroni din ganglioni dorsali spinali mentinuti in cultura in conditii de hipoxie (4% O­2 /hiperglicemie (25 mM glucoza) in prezenta sau absenta factorilor nervosi de crestere.
2. Standardizarea tehnicilor de marcare imunohistochimica si analiza Western Blot folosind biopsii de tegument de sobolan.
3. Recrutarea unui lot test de dimensiuni reduse de pacienti si testarea echipamentelor si a protocoalelor de studiu.
4. Realizarea modelului experimental de inregistrare electrofiziologica intracerebrala in vivo la sobolani.
5. Adaptarea metodelor clasice de studiu farmacologic la compusii luati in studiu si elaborarea de noi modele experimentale daca este necesar.

 

Rezultate

1. Un model experimental foarte bun pentru studierea fenomenelor care se produc la nivelul terminatiior nervoase periferice este folosirea culturilor primare de neuroni din ganglionii spinali (Bacaglini si col, 1983). Mentinerea lor in conditii diabetice (hipoxie, 4% O2 si hiperglicemie, 25 mM glucoza) ar putea fi un model foarte bun de investigare a modificarilor activitatii canalelor ionice si a influentei factorilor neurotrofici. Rezultatele au aratat ca neuronii spinali mentinuti in conditii care mimeaza diabetul, respectiv 4% O₂ si 25 mM glucoza, fata de conditiile normale de 7% O2 si 7.4 mM glucoza sunt viabili, rezista bine in cultura si au curenti de K+ si Na+ activati de voltaj si respectiv curenti activati de capsaicina care isi modifica amplitudinea in conditii diabetice. Acest rezultate dovedesc ca modelul nostru experimental este bun.
2. Pe biopsii de piele de sobolan s-a aplicat metoda clasică a coloraţiei cu albastru de metilen şi imunomarcarea cu anticorpi anti-PGP 9.5 (anti-protein-gene-product 9.5) care este un marker pentru examenul axonilor de la nivelul biopsiilor de piele. Metoda standardizata in acest fel va fi folosita pentru a caracteriza cât mai complet diferenţele de expresie şi localizarea mai multor markeri/receptori implicati in mecanismele durerii periferice.
3. Pentru evaluarea senzitiva obiectiva si standardizarea metodei de selectie a pacientilor care vor forma lotul de studiu s-au folosit urmatoarele criterii de includere: 1) Pacienti cu virste intre 30-70 ani; 2) Ambele sexe; 3) Criterii paraclinice de diabet zaharat (glicemie a jeun, hemoglobina glicozilata) diagnosticat de cel putin 1 an; 4) Examen neurologic sugestiv pentru neuropatie senzitiva cronica distala sau afectare neuropatica focala; 4) Durere cronica distala la nivelul membrelor inferioare ± superioare  sau focala mai veche de 3 luni; 5) Rating-ul durerii folosind bateria de scale prezentata nu trebuie sa fie mai mic de 4 pe scala numerica  si 40 de mm pe scala vizuala. Criterii de excludere: 1) afectiuni sistemice altele decat diabetul zaharat care pot produce neuropatie senzitiva dureroasa (boli autoimune, paraneoplazice sau toxice-carentiale, disproteinemii, colagenoze). Studiul de conducere senzitiva in teritoriile examinate a pus in evidenta viteze de conducere normale sau la limita inferioara a normalului, in schimb s-a observat diminuarea importanta a amplitudinii potentialului de actiune senzitiv care s-a corelat cel mai bine cu tulburarea senzitiva obiectiva si cu scorul durerii.
4. In aceasta etapa s-au identificat o serie de conexiuni din directia nucleului rafeului dorsal catre nucleii raphe obscurus si raphe pallidus. Intentionam sa incercam si reciproca, adica identificarea unor circuite cu pornire in nucleii rafeului central si traiect descendent catre nucleii bulbari, pentru a testa maniera in care nucleii rafeului dorsal, implicati in comportament, dispozitie, stari de constienta, ar putea interactiona cu nucleii bulbari prin caile descendente care controleaza mecanismul de poarta al durerii la nivel medular.
5. Pentru animalele de experienta la care s-a stimulat regiunea periapeductala cenusie situata la acelasi nivel cu nucleul rafeului dorsal s-a obtinut raspuns electric coerent cu pulsul de stimulare. Animalele de experienta raspund la substantele de testat, cea ce va permite investigarea mai detaliata a mecanismului lor de actiune.

 

Faza 2

Cercetari fiziofarmacologice privind influenta oligopeptidelor si oligoelementelor asupra sensibilitatii nociceptive si analgeziei. Studii privind mecanismele implicate in fiziologia durerii la nivelul circuitelor neuronale din sistemului nervos central.

1. Testarea efectelor unor oligopeptide si oligoelemente pe modelele animale luate in studiu.
2. Urmarirea comportamentul neuronilor corticali pe sectiuni de creier folosind tehnicile de inregistrari de microelectrofiziologie in vivo.
3. Investigarea proprietatilor neuronilor implicati in caile de producere si modulare a durerii in vitro prin studiul imunocitochimic al exprimarii de receptori caracteristici cailor algice, a markerilor de activare neuronala şi a celor de sensibilizare centrală. 
    

Rezultate

1. Peptidele opioide tipice au în comun o secvenţă peptidică caracteristică la capătul N-terminal, denumită motiv opioid sau motiv enkefalinic – secvenţa Tyr-Gly-Gly-Phe. S-a considerat multă vreme că că această secvenţă ar fi unica responsabilă de recunoaşterea opioizilor la nivelul receptorilor şi, de asemenea, de activitatea opioidă. Studiile realizate au demonstrat ca:
   1. Fragmentele de peptide opioide endogene administrate, cu trei sau chiar numai doi aminoacizi (Tyr-Gly-Gly sau Tyr-Gly) prezintă o activitate antinociceptivă asemănătoare cu cea a peptidului iniţial (pentapeptidul leucin-enkefalină, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu), chiar dacă mai puţin puternică.
   2. Efectul analgezic este în mod clar mediat prin sistemul opioidergic, întrucât este antagonizat de administrarea de naloxon.
   3. Studiile realizate pe fragmente de peptide opioide au demonstrat că, deşi prezenţa motivului enkefalinic Tyr-Gly-Gly-Phe este o garanţie pentru apariţia efectului analgezic, conservarea întregii secvenţe tetrapeptidice nu este absolut necesară. Mai mult, conservarea efectului analgezic de tip opioid este dependentă de poziţionarea tirozinei la capătul N-terminal.
   4. Studiile realizate pe fragmente de nociceptin au demonstrat ca prezenţa reziduului de glicină la capătul C-terminal al fragmentelor de nociceptin determină modularea în sens pronociceptiv a activităţii.
2. Rezultatele obtinute sugereaza existenta unei legaturi excitatorii intre substanta periapeductala cenusie si nucleul rafeului, probabil mediata de glutamat. Efectele nicotinei, preponderent excitatorii par a fi modulate de receptori presinaptici de nicotina, iar administrarea de mecamilamina, blocant nespecific pentru receptorii heteromerici alfa-beta, sugereaza blocarea efectelor nicotinice, cu pastrarea capacitatii stimulatorii a aferentelor din substanta periapeductala cenusie. Aceste date sunt concordante cu rezultate obtinute in laboratorul nostru din inregistrari pe sectiuni de creier in vitro. Raspunsul diferit al neuronilor de la acest nivel la administrarea de nicotina si de blocanti de nicotina, sugereaza mecanisme neurofarmacologice complexe implicate in modularea efectuata de diversele subtipuri de receptori nicotinici. In cazul stimularii efectuate la nivelul nucleilor bulbari ai rafeului nu s-a obtinut un raspuns coerent, sugerand lipsa unei legaturi directe a formatiunii bulbare asupra rafeului dorsal.
3. Rezultatele obtinute ilustreaza faptul ca stimularea dureroasa induce modificari de plasticitate neuronala la nivel medular, dar nu si la nivelul trunchiului cerebral, in speta la nivelul nucleului dorsal al rafeului. Modificarile plastice se caracterizeaza printr-o crestere semnificativa a numarului de celule c-fos imunoreactive la nivelul segmentelor C5-T2, in mod particular la nivelul segmentului C7.
    

Faza 3

Studiul activitatii canalelor ionice si a receptorilor pentru neurotrofine din neuronii nociceptivi de la sobolan aflati in conditii diabetice. Evaluarea excitabilitatii nervoase si a expresiei receptorilor pentru neurotrofine in fibrele nervoase periferice de la subiectii umani suferinzi de diabet.

1. Testarea efectelor conditiilor de hipoxie/hiperglicemie asupra curentilor de Na+ si K+ din culturile primare de neuroni spinali de sobolan folosind tehnica patch-clamp in configuratie whole-cell.
2. Descrierea şi estimarea morfologică a terminaţiilor nervoase din piele folosind fragmente de tegument recoltate de la sobolan, folosind atât metoda clasică a coloraţiei cu albastru de metilen cît şi imunomarcarea cu anticorpi anti-PGP 9.5.
3. Masurarea potentialelor de actiune colective din teritoriile nervoase median, ulnar folosind electroneurografia si electromiografia, urmarindu-se evaluarea vitezelor de propagare, a amplitudinii si ariei potentialului senzitiv, reflexul H, undele F, a potentialului evocat somestezic.
    

Rezultate

1. Pe culturi primare de neuroni din ganglionii spinali mentinuti timp de 24 de ore si, respectiv 48 de ore in conditii de hipoxie si hiperglicemie, s-a observat: 
   • o crestere nesemnificativa a curentului de sodiu rezistent la TTX in neuronii mentinuti 48 de ore in cultura in conditii diabetice.
     modificarea semnificativa a conductantei atat a curentului rezistent la TTX cat si a curentului sensibil la TTX.
   • o modificare nesemnificativa a curentilor de rampa (lenta si rapida) care sunt asociati cu excitabilitatea neuronilor.
   • s-a pus in evidenta un curent de K cu inactivare lenta, prin diferenta intre curentul total si curentul de tip  delayed-rectifier, fara inactivare; curentul de tip A, cu inactivare rapida lipseste.
   • s-a demonstrat o sensibilitate la TEA a ambelor tipuri de curenti de K identificati, curentul sensibil constituind mai mult de jumatate din curentul total.
2. Pentru identificarea terminaţiilor nervoase libere la nivel epidermal, s-au folosit coloraţii cu albastru de metilen în concentraţii foarte mici şi imunohistochimie cu anticorpi anti PGP 9.5.
3. Mǎsurarea amplitudinii potenţialului senzitiv(SNAP) sau a CMAP reprezintǎ un parametru mai bun pentru evaluarea pacientilor cu durere neuropatǎ comparative cu VCS sau VCM. Scorul pe scala "expresiei faciale" Wong Baker a durerii şi scorul pe scala numericǎ a indicat ca la 3 bolnavi predominǎ simptomele de anxietate; la nici un pacient nu s-au înregistrat diferenţe mari în favoarea scorului pe scala de depresie; 4 din cei 8 pacienţi ai seriei de cazuri sunt anxiosi –depresivi; la un pacient valorile scorului pe ambele scale au fost mici, prin urmare  nu prezintǎ semne de depresie, respectiv de anxietate.

 
Faza 4

1. Corelatii integrative intre rezultatele obtinute la nivel molecular, celular si al organismului in ceea ce priveste mecanismele periferice si centrale ale durerii luate in studiu.
2. Investigarea efectelor curentilor activati de pH (ASIC1a) din culturile primare de neuroni spinali de sobolan mentinute in conditii de hipoxie/hiperglicemie.
3. Evaluarea telemetrica a modificarilor de comportament si de parametri neuromotori la animalele implantate cronic cu electrozi epidurali pentru electrocorticograma si cu electrozi de electrocardiograma. Reunirea intr-o abordare unitara a observatiilor electrofiziologice si farmacologice facute pe modelele animale.
4. Realizarea unui screening privind expresia receptorilor pentru neurotrofine, a proteinelor care reglează semnalizarea neurotrofică si a altor peptide şi proteine posibil implicate în semnalizarea intracelulara pe fragmente de tegument recoltate de la pacienti diabetici si stabilirea de corelatii integrative intre rezultatele obtinute la nivel molecular, celular si organismic in ceea ce priveste mecanismele periferice si centrale ale durerii luate in studiu

Rezultate

1. Experimentele noaste au aratat ca hipoxia fizică per se nu explică modificările de expresie şi proprietăţi biofizice ale canalelor ionice de la nivelul somei neuronilor senzitivi primari care duc la apariţia neuropatiei diabetice, în timp ce combinaţia de hipoxie-hiperglicemie din cadrul modelului in vitro de neuropatie diabetică duce la o scădere marcată a curenţilor ASIC din sistemul nervos periferic, fapt ce ar putea exercita o contribuţie importantă în formele de neuropatie specifice diabetului zaharat, în care fibrele nervoase senzitive şi vegetative sunt primele afectate. Nu este încă extrem de clar ce anume duce la reducerea atât de accentuată a curenţilor ASIC din sistemul nervos periferic în condiţii diabetice: modificări la nivelul expresiei genelor diferitelor subunităţi ASIC, sau o procesare posttranslaţională anormală a proteinelor-canal pe calea de traficare spre membrana celulară (reticul endoplasmic rugos şi aparatul Golgi). Am putea presupune un status anormal de glicozilare al ectodomeniului canalelor ASIC în aceste condiţii, care să ducă la alterările funcţionale observate experimental.
2. Studiul a fost proiectat pentru a investiga rolul unor peptide opioide asupra receptorilor opioizi localizaţi periferic, în inflamaţia acuta. S-a optat pentru modelul de inflamaţie acuta cu carrageenan. S-au comparat efectele peptidelor opioide selectate administrate sistemic sau local. Rezultatele publicate susţin ideea cã receptorii opioizi periferici, la nivelul inflamaţiei sau de la nivelul celulelor imune locale sau circulante, nu sunt implicaţi în formarea edemului determinat de inflamaţia acuta. Mai mult, efectele antihiperalgezice ale peptidelor opioide administrate – leuenkefalina, endomorfina 1 si 2, nu sunt secundare reducerii edemului, întrucât edemul nu a regresat la momentul respectiv. Toate acestea par să indice o acţiune la nivelul receptorilor opioizi de la nivelul terminaţiilor nervoase senzoriale primare, decât o acţiune asupra celulelor sistemului imun. Cercetări ulterioare vor fi necesare pentru demonstrarea acestui fapt. Scaderea activarii neuronale talamice concomitent cu aparitia episoadelor de burst suppression pe EEG odata este asociata cu cresterea profunzimii anestezice. De asemenea,  rata de descarcare a neuronilor talamici a crescut in timpul episodului de stimulare a cailor algice, atat in timpul anesteziei superficiale, cat si a celei profunde, in cazul ambelor anestezice. Rezultatele obtinute demonstreaza faptul ca stimulii durerosi sunt condusi pe caile ascendente in timpul anesteziei superficiale si medii, activand un numar mai redus de neuroni de releu talamic.
3. S-au recoltat biopsii de piele de la pacienti diabetici, pe care s-au testat metodele de evidenţiere şi cuantificare morfologică şi imunologică a terminaţiilor nervoase libere nemielinizate epidermale. Rezultatele obtinute ne-au permis să facem o descriere şi o estimare morfologică a terminaţiilor nervoase din piele umană folosind atât metoda clasică a coloraţiei cu albastru de metilen cat şi imunomarcarea cu anticorpi specifici, ca de exemplu anti-PGP 9.5 (anti-protein-gene-product 9.5). S-au pus în evidenţă de asemenea, prin imunohistochimie şi Western blot, modificările de expresie a receptorilor de factor de creştere nervos (NGF) – TrkA şi p75NTR care apar la pacienţii cu neuropatie diabetică faţă de pacienţii din lotul control. Aceste rezultate sugerează că pacienţii cu neuropatie care exprimă receptori de factori trofici ar putea un prognostic clinic mai bun în ceea ce priveşte evoluţia clinică ulterioară a neuropatiei. Astfel, studiul nostru ar merita continuat pentru a confirma că expresia receptorilor TrkA în fragmentele bioptice de piele ar putea constitui un biomarker pentru prognosticul neuropatiei.

• Prec
• Următor